就二代测序技术在液体活检中的应用

在过去10年，高通量测序技术迅速发展，并成功利用于遗传性疾病及肿瘤的诊断。近，另外1个份子诊断领域的红人就是-液体活检技术。如能将高通量测序技术应用在液体活检上，将为份子诊断开辟1个更加广阔的天地。液体活检包括循环肿瘤细胞和游离核酸的检测。这期我们关注的是2代测序在检测循环肿瘤DNA中的利用。

顾名思义，循环肿瘤DNA是指血液循环中的DNA，来自肿瘤细胞。肿瘤细胞坏死或凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中。虽然这些DNA是断裂的，不完全的，但它来自于肿瘤细胞，如果肿瘤细胞携带某种基因突变，这些突变也能在循环肿瘤DNA中反应出来。通过检测循环肿瘤DNA的基因突变，就能够揭秘体内肿瘤组织的突变信息，从可以使图形以最好尺度显示而为肿瘤的靶向医治和药效检测提供根据。

此前已有文章介绍过微滴数字PCR技术可以非常有效的检测到循环肿瘤DNA中的突变，常触及的突变有EGFR的L858R突变,19外显子缺失,BRAF的V600E突变等，对这些位点的检测，准确性可以到达山东创新团体提出0.01，可以说目前为止还没有其他技术可以超出这类灵敏度。但是该技术有局限性：1，在做检测前必须明确要检测的位点，不能检测未知位点;2，1个位点1个位点地检测既耗时又增加了本钱。高通量测序技术正好可以弥补以上不足。

高通量测序检测循环肿瘤DNA，1般会选定10几到几10个肿瘤相干基因，技术关键在于如何富集这些相干基因。目前经常使用的富集方法有两种：PCR扩增法和探针捕获法。PCR扩增法是针对目的基因设计几10对乃至上百对PCR引物，利用多重PCR扩增富集。探针捕获法是针对目的基因设计探针，通过杂交的方法富集。由于从血液中得到的游离DNA大部份来自于正常的血细胞，循环肿瘤DNA只占极少的比例，更要求富集的进程要高效均1，乃至需要采取突变特异的富集方法，从而大可能地检测到来自肿瘤的突变DNA。

由于循环肿瘤DNA的2代测序检测准确、灵敏、无创且高通量，目前已用于靶向医治的实时监测。两个月前英国癌症研究所Bono实验室发表在《临床癌症研究》上的文章报导了循环肿瘤DNA的2代测序检测在监测靶向药物疗效中的利用。该研究来自1个针对PI3K-AKT-mTOR信号通路的靶向药物的临床实验，共39位病人参与此项研究，这39位病人均罹患癌症，在服药前已有不同程度的癌细胞转移迹象。首先，该研究证明外周血中检测到的突变均在手术活检样品中出现，说明循环肿瘤DNA可以反应肿瘤组织份子水平变化。接下来，在服用靶向药物进程中，每隔1段时间搜集外周血进行循环肿瘤DNA的测序，用以监控上述信号通路中的热门突变的变化，从而为判断药物的疗效提供根据，结果显示，循环肿瘤DNA突变的变化趋势与传统CT检测到的肿瘤大小变化基本1致，实现了肿瘤份子水平监控。靶向药物针对基因突变而设计，因此监测循环肿瘤DNA中的突变变化可以更灵敏准确地判断靶向药物的疗效。

高通量测序检测循环肿瘤DNA技术,既然只需要少许的外周血，就能够检测出肿瘤DNA中的突变，这个技术是不是可以用在肿瘤初期筛查呢?由于肿瘤初期，外周血中含有的肿瘤DNA极为微量，要做到肿瘤初期检测，对灵敏度要求非常非常高。目前已有报导，通过优化实验方案，提高检测灵敏度。肿瘤循环DNA的2代测序是不是可以成功地用于癌症因此自然成为大家关注的焦点筛查，我们拭目以待。